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蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)人員是如何區(qū)分，分離純化這些蛋白質(zhì)的呢？蛋白質(zhì)純化有哪些方法？機(jī)理是怎么樣的？跟嘉鵬一起來get新知識吧。
能從成千上萬種蛋白質(zhì)混合物中純化出一種蛋白質(zhì)的原因,是不同的蛋白質(zhì)在它們的許多物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)有著大的不同,這些性質(zhì)是由于蛋白質(zhì)的氨基酸的序列和數(shù)目不同造成的,連接在多肽主鏈上氨基酸殘基可是荷正電的、荷負(fù)電的、極性的或非極性的、親水的或疏水的,此外多肽可折疊成非常確定的二級結(jié)構(gòu)(α螺旋、β折疊和各種轉(zhuǎn)角)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu),形成獨(dú)特的大小、形狀和殘基在蛋白質(zhì)表面的分布狀況,利用待分離的蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)之間在性質(zhì)的差異,即能設(shè)計出一組合理的分級分離步驟。可依據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)與之相對應(yīng)的方法將蛋白質(zhì)混合物分離。




分子大小
不同種類的蛋白質(zhì)在分子大小方面有一定的差別,可用一些簡便的方法,使蛋白質(zhì)混合物得到分離。
(1)透析和超濾透析在純化中極為常用,可去除鹽類(脫鹽及置換緩沖液)、有機(jī)溶劑、低分子量抑制劑等。超濾一般用于濃縮和脫色。
(2)離心分離置換緩沖液許多酶富集于某一細(xì)胞器內(nèi),勻漿后離心得到某一亞細(xì)胞成分,使酶富集10-20倍,再對特定的酶進(jìn)行純化。差速離心,分辨率較低,僅適用于粗提或濃縮。速率區(qū)帶法,如離心時間太長所有的物質(zhì)都會沉淀下來,故需選擇*佳分離時間,可得到相當(dāng)純的亞細(xì)胞成分用于進(jìn)一步純化,避免了差速離心中大小組分一起沉淀的問題,但容量較小,只能用于少量制備。等密度梯度離心常用的介質(zhì)有蔗糖、聚蔗糖、氯化銫、溴化鉀、碘化鈉等。
(3)凝膠過濾這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物*有效的方法之一,注意使要分離的蛋白質(zhì)分子量落在凝膠的工作范圍內(nèi)。選擇不同的分子量凝膠可用于脫鹽、置換緩沖液及利用分子量的差異除去熱源。
形狀
蛋白質(zhì)在離心通過溶液運(yùn)動時,或通過膜、凝膠過濾填料顆?；螂娪灸z中的小孔運(yùn)動時,都會受到形狀的影響。對兩種相同質(zhì)量的蛋白質(zhì)而言,球狀蛋白質(zhì)具有較小的有效半徑(斯托克半徑),通過溶液沉降時遇到的摩擦力小,沉降較快而顯得比其它形狀的蛋白質(zhì)大;反之,在體積排阻色譜時,斯托克半徑較小的球狀蛋白質(zhì)更容易擴(kuò)散進(jìn)入凝膠過濾填料顆粒內(nèi)部,較遲洗脫出來,因而顯得比其它形狀的蛋白質(zhì)要小。
溶解度
利用蛋白質(zhì)的溶解度的差別分離各種蛋白質(zhì)常用的方法。影響蛋白質(zhì)溶解度的外界因素很多,其中主要有:溶液的pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度,但在同一的特定外界條件下,不同的蛋白質(zhì)具有不同的溶解度。適當(dāng)改變外界條件,控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度。
(1)pH控制和等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)一般較不易溶解。
(2)有機(jī)溶劑分離法蛋白質(zhì)在不同的溶劑中的溶解度有很大不同,從基本不溶(<10ug/ml)直至極易溶解(>300mg/ml)不等。引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同,故控制有機(jī)溶劑的濃度可分離蛋白質(zhì)。水溶性非離子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白質(zhì)的沉淀。
(3)溫度不同的蛋白質(zhì)在不同的溫度具有不同的溶解度和活性。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定,故分離操作一般在0℃或更低溫度下進(jìn)行。
電荷
蛋白質(zhì)凈電荷取決于氨基酸殘基所帶的正負(fù)電荷的總和,如中性溶液中帶凈負(fù)電荷則稱為酸性蛋白質(zhì)。
(1)電泳不僅是分離蛋白質(zhì)混合物和鑒定蛋白質(zhì)純度的重要手段,而且也是研究蛋白質(zhì)性質(zhì)很有用的方法。等電聚焦分辨率很高,pI有0.02pH的差異就能分開。2D-PAGE分離蛋白質(zhì)分辨率已經(jīng)發(fā)展到100000個蛋白點(diǎn)。
(2)離子交換層析改變蛋白質(zhì)混合物溶液中的鹽離子強(qiáng)度、pH和(陰、陽)離子交換填料,不同蛋白質(zhì)對不同的離子交換填料的吸附容量不同,蛋白質(zhì)因吸附容量不同或不被吸附而分離。
洗脫可采用保持洗脫劑成分一直不變,也可采用改變洗脫劑的鹽度或pH的方法洗脫,后一種可分為分段洗脫和梯度洗脫。梯度洗脫一般效果較好,分辨率高,特別是交換容量小,對鹽濃度敏感的離子交換劑,多用梯度洗脫。控制洗脫劑的體積(與柱床體積相比)、鹽濃度和pH,樣品組分能從離子交換柱上分別洗脫下來。
疏水性
多數(shù)疏水性的氨基酸殘基藏在蛋白質(zhì)的內(nèi)部,但也有一些在表面。蛋白質(zhì)表面的疏水性氨基酸殘基的數(shù)目和空間分布決定了該蛋白質(zhì)是否具有與疏水柱填料結(jié)合從而利用它來進(jìn)行分離的能力。因其廉價和純化后的蛋白質(zhì)具有生物活性,是一種通用性的分離和純化蛋白質(zhì)的工具。高濃度鹽水溶液中蛋白質(zhì)在柱上保留,在低鹽或水溶液中蛋白質(zhì)從柱上被洗脫,故特別適用于濃硫酸銨溶液沉淀分離后的母液以及該沉淀用鹽溶解后的含有目標(biāo)產(chǎn)品的溶液直接進(jìn)樣到柱上,當(dāng)然也適用7mol/L鹽酸胍或8mol/L脲的大腸桿菌的蛋白質(zhì)提取液直接進(jìn)樣到柱上,在分離的同時也進(jìn)行了復(fù)性。
親和能力
結(jié)合效率高,分離速度快的特點(diǎn)。配基可以是酶的底物、抑制劑、輔因子、特異性的抗體。吸附后可改變緩沖液的離子強(qiáng)度和pH的方法,洗脫下來,也可用更高濃度的同一配體溶液或親和力更強(qiáng)的配體溶液洗脫。按配基的不同可分為:
(1)金屬螯合介質(zhì)過渡金屬離子Cu2+、Zn2+和Ni2+等以亞胺絡(luò)合物的形式鍵合到固定相上,由于這些金屬離子與色氨酸、組氨酸和半胱氨酸之間形成了配價鍵,從而形成了亞胺金屬-蛋白螯合物,使含有這些氨基酸的蛋白被這種金屬螯合親和色譜的固定相吸附。螯合物的穩(wěn)定性受單個組氨酸和半胱氨酸解離常數(shù)所控制,從而亦受流動相的pH和溫度的影響,控制條件可以使不同蛋白質(zhì)相互分離。
(2)小配體親和介質(zhì)配體有精氨酸、苯甲酰胺、鈣調(diào)因子、明膠、肝素和賴氨酸等等。
(3)抗體親和介質(zhì)即親和層析,配體有重組蛋白質(zhì)A和重組蛋白G,但蛋白A比蛋白G專一,蛋白G能結(jié)合更多不同源的IgG。
(4)顏料親和介質(zhì)染料層析的效果主要取決于染料配基與酶的親和力大小外,還與洗脫緩沖液的種類、離子強(qiáng)度、pH值及

 
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